《武汉工程大学学报》  2008年04期 36-38   出版日期：2008-04-30   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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乙酰化莼菜多糖中单糖组分的GCMS分析


0引言莼菜（Brasenia schreber J.F.Gmel）系睡莲科植物［1］，莼菜鲜样含水量高达97.5%，总糖含量为0.86%，其中主要是莼菜多糖，存在于莼菜茎叶上的透明黏液质中.研究表明，从各种动植物中提取的多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌消炎和促进免疫等方面的生物功能［2~4］.一些多糖已经制成药剂，用于临床治疗和保健.无论是多糖产品的开发，还是多糖生物功能的研究，都要求对多糖中单糖的组成进行分析.由于多糖的结构相当复杂，国内外研究者在多糖的分离提取纯化和结构分析方面已经做了不少工作，为了进一步开发和利用莼莱多糖资源，我们进行了深入的研究.由于单糖存在于植物果实中且结构复杂, 进行分离纯化以及纯度鉴别较困难, 因而必须寻求一种高效分离和高灵敏度检测鉴定多糖组分中单糖结构的气相色谱一质谱分析方法.由于糖类本身没有足够的挥发性，因此进行气相色谱分析时，必须先将其转化成易挥发，对热较稳定的衍生物.通常用的衍生化方法是硅烷化或乙酰化.由于硅烷化会产生衍生物的异构体，在色谱图上出现多峰，给定性和定量带来困难.如果采用先将糖还原为糖醇，再衍生为乙酸酯的方法，就可避免衍生物异构体的产生，进行色谱分析时，每种单糖都可以得到单峰，该法具有定性简单、可靠和定量准确的优点.1实验部分1.1样品、试剂与仪器莼菜购于湖北省利川市清源（野生）蔬菜加工厂，经湖北民族学院中药研究所监制，所有化学试剂均为分析纯.Nicolet impact 420付立叶变换红外光谱仪（美国尼高力公司）；Finnigan Trace GCMS气相色谱质谱联用仪（美国热电菲尼根质谱公司）.1.2实验方法
1.2.1多糖化合物的提取及纯化方法称取500 g洗净晒干的莼菜，经过研磨后加入1：1的乙醇乙醚混合液，65 ℃水浴回流3 h去脂，残渣中加水，90～100 ℃水浴提取3～5 h，更换清水反复提取2～3次，合并深绿色多糖提取液,过滤，浓缩.向提取液中加入4倍体积的乙醇、离心分离，沉淀即为混合多糖粗品.用Sevag法除去多糖粗品中的蛋白质，H2O2除去色素，浓缩，冻干，即得多糖纯品.
1.2.2多糖的水解取多糖样品15 mg于安瓶中加入4 mol/L三氟乙酸4 mL，密封后在120 ℃恒温 水解5h，用N2吹干三氟乙酸，加甲醇并吹干；
1.2.3单糖的还原水解产物加入0.5 mL、0.05 mol/L KOH溶液，再加入10 mgKBH4，室温下反应6～8 h，加少许乙酸分解过量KBH4，至无气泡产生为止.蒸干反应液，以酸性甲醇洗涤反应产物，蒸干甲醇液，重复3～4次以除去硼酸根，最后加入甲醇蒸干并于烘箱中105 ℃除净水份.
1.2.4乙酰化衍生物取水解得的单糖5 mg，加入0.5 mL吡啶.1 mL乙酸酐,加热2 h，冷却后加入甲苯2 mL，用N2吹干，加入三氯甲烷，蒸馏水洗涤，用N2吹干得到棕黄色的产物.此乙酰化的单糖醇用三氯甲烷稀释后进行气相色谱质谱分析.1.3GCMS分析条件DB1色谱柱（美国安捷伦公司），（30 m×0.25 mm i.d，0.25 μm）；EI源，电子能量70 eV，分子量扫描范围35～550 amu，进样口温度220 ℃，接口温度220 ℃，载气氦气0.4 MPa；分流比25∶1，程序升温60 ℃5 ℃/min280 ℃（3 min）.2结果讨论2.1莼菜提取物中多糖的鉴定分析Molisch实验：硫酸和多糖溶液分为两层，层与层之间有紫色环出现.说明提取物确含有糖.混合多糖纯品的FIIR谱图如图1所示.谱图中多处可见到多糖的特征峰.如：3 315 cm-1，2 933 cm-1的吸收峰分别为O—H，C—H的伸缩振动峰，1 122 cm-1，1 084 cm-1处的吸收峰是多糖中C—O，C—O—C的伸缩振动和C—OH的弯曲振动特征峰.在1 000~700 cm-1的吸收峰则是α和β吡喃单糖形成的特征.第4期张平，等：乙酰化莼菜多糖中单糖组分的GCMS分析
武汉工程大学学报第30卷
图1 莼菜多糖的IR光谱图
Fig.1Fourier transform infrared spectrogram of polysaccharide2.2乙酰化多糖中单糖组分的GCMS分析总离子流图如图2所示，其质谱解析结果列于表1，经碎片分析并利用标准质谱NIST库进行检索，图2中14个色谱峰被确认为单糖的乙酰化衍生物，从表1中的峰面积百分比数据可以看出，αD吡喃葡萄糖，βD吡喃甘露糖，L鼠李糖、山梨糖、D阿拉伯糖、D呋喃半乳糖，在该混合多糖中所占的比例较大，是莼菜多糖的主要成分，与相关报道莼菜多糖的化学结构基本一致［5~7］.图2混合多糖乙酰衍生化的总离子流色谱图
Fig.2Gas chromatographymass spectrometric (GC MS) total ion current profile of the acetylation of fractions表1多种多糖的乙酰化衍生物气相色谱质谱分析结果
Table 1Gas chromatographymass spectrometric (GCMS) analysis results from acetylation of fractions
保留时间t/min分子式相对分子量单糖衍生物Derivatives of Monosaccharide峰面积百分比/%27.80C14H20O9332四乙酰化βL鼠李糖Tetraacetyl β1rhamnose7.6927.93C14H2OO93322,3,4三O乙酰化六脱氧αD吡喃葡萄糖Acetyl,2,3,4trioacety16deoxyαDglucopyranoside2.4828.18C16H22O11390五O乙酰化山梨糖Sorbose , PertaOactyl6.9628.28C13H18O9318四乙酰化来苏糖Lyxopyranose tetraacetate3.2530.16C15H22O103621,2,3,4,5五O乙酰化D木糖醇1,2,3,4,5pentaOacetylDxylitol0.3532.00C13H18O93181,2,3,5四乙酰化β呋喃核糖1,2,3,5Tetraacetylβribofuranose1.2332.98C13H18O93182,3,4,5四乙酰化D阿拉伯糖DArabinose 2,3,4,5tetraacetate2.2533.25C16H22O11390五乙酰化αD吡喃葡萄糖αDGlucopyranose, Pentaacetate45.5933.33C16H22O11390五酰化βD吡喃甘露糖βdMannopyranose, Pentaacetate9.8733.65C16H22O11390五乙酰化D呋喃葡萄糖DGlucofuranose, Pentaacetate1.4233.82C16H22O11390五乙酰化D呋喃半乳糖DGalactofuranose, Pentaacetate2.6834.12C16H22O11390五乙酰化甘露糖Mannose Pentaacetate0.5034.41C14H2OO104201,2,4,6四乙酰化D葡萄糖 1,2,4,6Tetraacetyldglucose34.57C18H26O12434六乙酰化艾杜糖Iditol hexaacetate0.3343结语a. 莼莱多糖的提取采用的是乙醇沉淀法，利用多糖不溶于乙醇，则可得到多糖粗产品. b. 莼莱多糖粗品的纯化，是用Sevag法除去多糖粗品中的蛋白质，双氧水法除去色素，浓缩，冻干，即得多糖纯品.c. 通过对莼莱中多糖中的单糖组分分析可知其主要成份为βD吡喃甘露糖，αD吡喃葡萄糖，山梨糖，来苏糖，D阿拉伯糖，β呋喃核糖，βL鼠李糖，D呋喃半乳糖等，与相关报道莼莱多糖的化学结构基本一致.