纳豆激酶是纳豆在发酵过程中由纳豆芽孢杆菌产生的一种具有强力纤溶活性的碱性丝氨酸蛋白酶［1］。纳豆激酶的主要作用是溶解血栓［2］，且溶血栓活性是纤溶酶的4倍［3］。纳豆激酶还具有保护肝脏和神经［4-6］、促进口腔黏膜炎的愈合［7］、治疗高血压、减少水肿、预防骨质疏松和避免脑出血等多种功效［8-9］。

纳豆激酶等电点为8.6、在pH小于5或者大于10时，会迅速失活［10］。牛血清蛋白、蛋白胨、明胶、甘油、丙二醇和海藻酸钠等能显著提高纳豆激酶的稳定性［11-13］。将纳豆激酶做成合适的剂型，能够提高纳豆激酶的稳定性和利用率［14-16］。微胶囊是一种容器，这种容器可以是中空的，也可以有填充物质在其中［17］。采用海藻酸钠胶囊包埋可以显著提高耐酸性，可以起到保护活性物质以及缓释作用。因此，为了提高纳豆激酶的利用率，采用海藻酸钠包埋纳豆激酶制成肠溶胶囊，使其能顺利到达小肠被吸收。本实验室筛选出了高产菌株发酵生产纳豆激酶［18-19］。本研究通过响应面法优化了制备纳豆激酶肠溶胶囊的条件。

1 实验部分

1.1 材料与设备

纳豆激酶，为本实验室筛选出的枯草芽孢杆菌YC4发酵制得［20］。海藻酸钠（sodium alginate，SA）、羧甲基纤维素钠（caboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）、氯化钙（CaCl2）、胃蛋白酶、胰蛋白酶，购于国药集团化学试剂有限公司；牛血清纤维蛋白原、凝血酶，购于上海源叶生物科技有限公司。紫外分光光度计UV-1800，苏州岛津仪器有限公司。

1.2 纳豆激酶肠溶胶囊的最佳制备工艺

配制20 mL的SA和CMC-Na溶液，加热搅拌至溶解，冷却至室温后加入纳豆激酶发酵上清液10 mL，搅拌至混合均匀。配制20 mL CaCl2溶液于锥形瓶中，放于磁力搅拌器上缓慢搅拌。用注射器将纳豆激酶SA混合溶液逐滴滴入CaCl2溶液中。滴入完毕后，静置0.5 h使胶囊固化，然后筛出微胶囊用超纯水冲洗几遍，即得到纳豆激酶肠溶胶囊。

1.3 纳豆激酶酶活（FU）测定

采用紫外分光光度计法测纳豆激酶酶活，具体操作按照《广东省食品安全地方标准》中关于纳豆粉的附录A《纳豆激酶测定方法-紫外分光光度法》进行。

1.4 包埋率计算

胶囊制备过程中，一部分纳豆激酶被包埋进胶囊，另一部分纳豆激酶溶解在CaCl2溶液中。通过测定原酶液和CaCl2溶液中的纳豆激酶酶活即可计算出包埋率，计算公式如下：

[包埋率%=1-CaCl2溶液中的纳豆激酶酶活(FU)纳豆激酶原酶液酶活(FU)×100%]

1.5 纳豆激酶肠溶胶囊制备的单因素实验

纳豆激酶肠溶胶囊制备的单因素实验设计如表1所示。

表1 纳豆激酶肠溶胶囊制备的单因素实验设计

Tab.1 Single factor experimental design for preparation of

nattokinase enteric capsules g/L

[方法 SA质量浓度 CMC-Na

质量浓度 CaCl2

质量浓度 SA单因素实验 10、20、30、

40、50 3 8 CMC-Na单因素实验 30 1、2、3、4、5 8 CaCl2单因素实验 30 3 2、5、8、

11、14 ]

1.6 纳豆激酶肠溶胶囊制备的响应面实验

在单因素实验的基础上，进行响应面实验，选取SA质量浓度（A）、CMC-Na质量浓度（B）、CaCl2质量浓度（C）3个因素为自变量，每个因素设置3个水平，以纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率为响应值，按照Design Expert 11软件中的Box-Behnken进行响应面实验。响应面试验因素与水平如表2所示。

表2 响应面试验因素与水平

Tab. 2 Factors and levels in response surface experiments

g/L

[水平 因素 A（SA） B（CMC-Na） C（CaCl2） -1 20 2 5 0 30 3 8 1 40 4 11 ]

1.7 模拟胃肠道实验

将制得的纳豆激酶肠溶胶囊放于人工胃液中37 ℃、180 r/min处理2 h，将胶囊滤出用超纯水冲洗3遍，再放入人工肠液中37 ℃、180 r/min处理3 h，测量人工肠液中的酶活。同时将纳豆激酶原液放于人工胃液中37 ℃、180 r/min处理2 h，测量人工胃液中的酶活。

2 结果与讨论

2.1 纳豆激酶酶活（FU）测定标准曲线的绘制

利用紫外分光光度法测纳豆激酶酶活，结果如图1所示。

<G:\武汉工程大学\2025\第1期\李迪文-1.tif>

图1 纳豆激酶酶活标准曲线

Fig.1 Standard curve of Nattokinase enzyme activity

由图1可知，纳豆激酶酶活与吸光度的标准回归方程为：y=18.937x-0.004 2，其中R2=0.998 3。表明吸光度在0.0~0.2的范围内，紫外分光光度法测纳豆激酶酶活的线性关系良好。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 SA浓度对包埋率的影响 由图2可知，SA质量浓度在10~50 g/L的范围内，纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率呈先上升后下降的趋势。在SA质量浓度为30 g/L时，纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率达到最高，为86.04%。

<G:\武汉工程大学\2025\第1期\李迪文-2.tif>

图2 SA浓度对包埋率的影响

Fig. 2 Effect of SA mass concentration on

embedding rate

2.2.2 CMC-Na浓度对包埋率的影响 由图3可知，CMC-Na质量浓度在1~5 g/L的范围内，纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率呈先上升后下降的趋势。在CMC-Na质量浓度为3 g/L时，纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率达到最高，为86.20%。

2.2.3 CaCl2浓度对包埋率的影响 由图4可知，CaCl2质量浓度在2~14 g/L的范围内，纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率先略微下降再增高，质量浓度为8 g/L时，纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率达到最高，为86.063%，然后随质量浓度增大，包埋率下降。当CaCl2质量浓度低于2 g/L时，纳豆激酶肠溶胶囊不成型，变成一整块，导致包埋率偏高。所以最佳CaCl2质量浓度选择为8 g/L。

<G:\武汉工程大学\2025\第1期\李迪文-3.tif>

图3 CMC-Na质量浓度对包埋率的影响

Fig. 3 Effect of CMC-Na mass concentration on

embedding rate

<G:\武汉工程大学\2025\第1期\李迪文-4.tif>

图4 CaCl2浓度对包埋率的影响

Fig. 4 Effect of CaCl2 mass concentration on

embedding rate

2.3 响应面实验结果

2.3.1 Box-Behnken中心组合实验方案实验及结果 根据Box-Behnken中心组合实验方案设计条件进行实验，测定不同条件下纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率，实验设计及结果如表3。

2.3.2 回归模型方差分析 以纳豆激酶肠溶胶囊的包埋率为指标，利用Design-Expert 11软件对表3中的实验结果进行分析，得到纳豆激酶肠溶胶囊包埋率的回归方程式为：

包埋率=87.22+0.92A+0.19B-0.17C-0.04AB-0.04AC-0.023BC-2.68A2-0.58B2-0.92C2。

对回归方程进行方差分析，结果如表4。从表4可知，模型的显著性极高，其中一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2影响显著，其他项影响不显著。可以看出，SA的质量浓度对纳豆激酶肠溶胶囊包埋率的影响最大，CMC-Na质量浓度的影响次之，CaCl2浓度的影响最小。响应面模型P值小于0.001，表现为极显著，同时失拟项P值为0.974 3，表现为不显著，说明模型有着较好的稳定性。模型的相关系数R2为0.995 8，说明模型与实际实验的拟合度好，校正后的决定系数R2Adj为0.990 3，与R2接近，说明模型有很好的准确性和通用性。因此，这个模型可以用来预测纳豆激酶肠溶胶囊制备的最佳条件。

2.3.3 响应面交互作用分析 在回归模型方差分析的基础上，利用Design-Expert 11软件绘制各交互项的响应面图和等高线图，可直观地看出各因素对纳豆激酶肠溶胶囊包埋率的影响，见图5。

由图5可以看出，SA方向上响应曲面较陡，等高线密集，说明SA的质量浓度对包埋率的影响较为显著，CMC-Na和CaCl2的质量浓度对应的坡度较平缓，表明这两个因素对纳豆激酶肠溶胶囊包埋率的影响较不显著。

2.3.4 响应面优化条件验证实验 利用Design-Expert 11软件推算出的最优制备条件为：SA质量浓度36.43 g/L、CMC-Na质量浓度3.15 g/L、CaCl2质量浓度7.69 g/L，预计包埋率87.63%。用最优制备条件进行3次重复实验，包埋率的平均值为87.55%，与预测值基本相符，表明该制备条件可靠。

2.4 模拟胃肠道实验

如图6所示，用最优制备条件制得的纳豆激酶肠溶胶囊经过2 h人工胃液和3 h的人工肠液处理后，在肠液中检测到的酶活为20.35 FU/mL。而在同样的条件下，纳豆激酶裸酶经过2 h人工胃液处理，酶活仅剩1.36 FU/mL。这表明制得的纳豆激酶肠溶胶囊具备显著的抵御胃酸的保护作用，同时能够在肠液中得以释放，发挥功效。

3 结 论

本实验用响应面法对纳豆激酶微胶囊的制备条件进行优化，确定最优制备条件为：SA质量浓度36.43 g/L、CMC-Na质量浓度3.15 g/L、CaCl2质量浓度7.69 g/L，预计包埋率87.63%。用最优条件进行验证实验，得到的包埋率的平均值为87.55%，与预测值基本相符，表明该制备条件可靠。纳豆激酶肠溶胶囊经过2 h人工胃液和3 h的人工肠液处理后，在肠液中检测到的酶活为20.35 FU/mL。而在同样条件下，纳豆激酶裸酶经2 h人工胃液处理，酶活仅剩1.36 FU/mL。实验表明纳豆激酶肠溶胶囊具有显著的耐酸性，能有效地保护纳豆激酶通过酸性环境，为纳豆激酶的保健药品开发提供了理论依据和工艺参数。