《武汉工程大学学报》  2011年01期 25-27   出版日期：2011-01-30   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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茯苓菌核多糖分离技术研究



0引言茯苓（Poria cocos）是我国传统的药用真菌.茯苓的主要成分是β-茯苓聚糖.从茯苓中提取制备的茯苓多糖或茯苓异多糖具有促进细胞分裂、补体激活、抗诱变、抗肿瘤、增强免疫等生物活性.为此,从茯苓菌核中提取茯苓多糖的技术研究具有重要的应用价值.目前,文献报道的分离茯苓菌核多糖的方法有热水浸提法、稀碱浸提法、酶法、微波、超声波辅助提取法等［15］.热水浸提法的浸提时间长且提取率较低,稀碱浸提法的浸提步骤繁琐反应剧烈, 极易破坏茯苓多糖生物活性.酶法简化了多糖提取工艺,提取率大幅提高,但提取成本增加.微波法提取时间明显缩短,既节能又高效,超声波提取法无需加热,可缩短提取时间,有较高的提取率,但微波法和超声波提取法有设备要求.如何能将这些方法有效地结合起来, 将其集成创新,提出适宜规模化生产的茯苓多糖提取技术,进一步提高茯苓多糖的提取率是具有现实意义的.1实验部分1.1材料、试剂和仪器茯苓块,湖北罗田产, 市场购买.将茯苓块置60 ℃烘烤2～3 h,粉碎过孔径0.15 mm筛,收集粉末于棕色瓶中避光保存备用.纤维素酶,上海伯奥生物科技有限公司,酶活大于15 U·mg-1;木瓜蛋白酶,Sigma公司, 800 U·mg-1;葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、苯酚、浓硫酸等均为国产分析纯试剂.BL220H岛津电子天平,岛津国际贸易（上海）有限公司;722E可见光光度计,天津市普瑞斯仪器有限公司;DKS24型电热恒温水浴锅,上海精宏实验设备有限公司;SHBIIIA循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;DHG9053A型电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;WP800 TL23K3微波炉,Galanz;BCD182B海尔电冰箱.1.2方法
1.2.1多糖分离a. 热水浸提法.据文献［23］得到两组不同热水浸提工艺条件: 第一组为料水比130、温度70 ℃、热水浸提2 h,浸提两次,第二组为料水比170、温度100 ℃、热水浸提2.5 h,提取两次.本文重复了这两组提取工艺,结果表明两组工艺条件的提取率相近,为此选取耗能少的第一组单因子试验结果来进行L9（33）正交试验,热水浸提法正交试验因素与水平见表1.表1热水浸提法正交试验L9（33）因素与水平
Table 1Factors and Levels of orthogonal tests of hot water extraction method
水平因素A(料水比)/（g/mL）B(浸提时间)/hC(浸提温度)/ ℃ 11201.56021302.07031402.580b. 微波法.采用文献［4］及热水浸提实验结果,进行L9（33）正交试验,考察料水比、功率,微波处理时间对多糖提取效果的影响.微波法正交试验因素与水平见表2.表2微波的正交试验L9（33）因素与水平
Table 2Factors and Levels of orthogonal tests of microwave method
水平因素A(料水比)/（g/mL）B(浸提时间)/minC(功率)/W112041362130529631406320c. 酶法.单酶法［5］采用0.5%的木瓜蛋白酶,最适宜pH为6,60 ℃提取2 h.复合酶法［6］采用木瓜蛋白酶与纤维素酶一起作用,其用量之比为21,其中木瓜蛋白酶质量分数为0.3%,纤维素酶质量分数为0.15%,最适宜pH为4.5,45 ℃提取4 h.分别称取1 g茯苓粉经酶法处理后,抽滤,测定滤液中多糖的含量.d. 热水浸提法、微波与酶法两两集成提取.首先用优化的热水浸提法进行提取,水提完成后,抽滤,滤渣用优化的微波条件进行提取,最后抽滤,合并两次得到滤液,进行多糖含量的测定.然后通过调整提取顺序,测定其他5个组合集成提取液的多糖含量.e. 热水浸提法、微波与酶法集成提取.首先用优化的热水浸提法进行提取,水提完成后,抽滤,滤渣用优化的微波条件进行提取,抽滤,滤渣用优化的酶法进行提取,最后抽滤,合并三次得到滤液,进行多糖含量的测定.然后通过调整提取顺序,测定其他5个组合集成提取液的多糖含量.
1.2.2多糖的测定多糖含量的测定采用苯酚—硫酸法［7］.第1期张凯,等:茯苓菌核多糖分离技术研究
武汉工程大学学报第33卷
2结果与讨论2.1热水浸提法的正交试验热水浸提法正交试验结果与分析见表3.表3正交试验结果与分析
Tablet 3Results and analysis of orthogonal design tests
试验号因素ABC多糖含量/
（mg·g-1）11114.0721229.831336.8421212.552238.962311273136.283219.293327.3K16.897.598.42K211.139.39.87K37.578.77.3R4.241.712.57由表3可知,影响多糖含量的主次顺序是A>C>B,即料水比>浸提温度>浸提时间.根据各水平下K1、K2、K3确定各因素的最优水平组合为A2B2C2,由此可见,料水比对多糖含量影响最大,其次为浸提温度和浸提时间.综合考虑,采用热水浸提法进行多糖提取的最佳工艺条件为料水比130,浸提温度70 ℃,浸提时间2 h,浸提2次.本研究热水浸提法的多糖提取率高于文献［23］报道的结果.2.2微波法的正交试验微波法的正交试验结果与分析见表4.表4微波的正交试验结果与分析
Tablet 4Results and analysis of orthogonal design tests of microwave method
试验号因素ABC多糖质量含量/
（mg·g-1）11118.98121229.11631335.09142126.42052237.213623110.59073139.78783217.04793326.842K17.7298.3967.679K28.0747.7929.831K37.8927.5086.186R0.3450.8883.645 * 表中数据均为3次重复试验的平均值.由表4可知,影响多糖含量的主次顺序是C>B>A,即提取功率> 浸提时间>料水比.根据各水平下K1、K1、K2确定各因素的最优水平组合为A2B1C2,由此可见,功率对多糖含量影响最大,其次为浸提时间和料水比.综合考虑,采用微波进行多糖提取的最佳工艺条件为料水比130,浸提时间4 min,提取功率为296 W.经实验验证,微波最佳组合多糖提取量为11.436 mg·g-1符合正交实验结果.本研究微波法处理的多糖提取率远低于文献［45］报道的结果,分析可能与所用微波仪器不同以及参数设置不同有关.2.3酶法提取多糖试验采用单酶法和复合酶法提取多糖试验结果分别为237.537 mg·g-1和200.175 mg·g-1.酶法提取多糖的效率很高,比微波法和热水浸提法都要高出不少,是提取茯苓多糖效率比较高的一种方法。综合考虑酶量和节能,酶法进行多糖提取的最佳工艺条件采用单酶法.2.4集成提取多糖试验集成提取多糖试验结果见表5和表6.表5两种方法集成提取茯苓多糖试验结果
Table 5Results of two methods integrated extraction tests of polysaccharides of Poria cocos
A+BA+CB+AB+CC+AC+B多糖/(mg·g-1)148.9116.466249.619254.73718.321252.649注：*表中数据均为3次重复试验的平均值.A代表热水浸提法,B代表单酶法,C代表微波法.表6三种方法集成提取茯苓多糖试验结果
Table 6Results of three methods integrated extraction tests of polysaccharides of Poria cocos
A+B+CA+C+BB+A+CB+C+AC+A+BC+B+A多糖/(mg·g-1)155.29179.858253.341256.368208.637257.449注：*表中数据均为3次重复试验的平均值.A代表热水浸提法,B代表单酶法,C代表微波法.由表5可知,以酶法+微波法的多糖提取率最高, 微波+酶法的多糖提取率稍低, 酶法与微波法两个组合的多糖提取率均高于单酶法.其他组合的多糖提取率均低于单酶法.本研究热水浸提法与酶法的多糖提取率高于文献［8］报道的结果.本研究酶法与微波法的多糖提取率也高于文献［5］报道的结果.由表6可知,以微波法+酶法+热水浸提法的多糖提取率最高, 酶法+微波法+热水浸提法的多糖提取率与微波法+酶法+热水浸提法的多糖提取率接近, 这两个组合的多糖提取率比酶法与微波法两个组合的多糖提取率略高.3结语综合考虑多糖提取效率、提取时间和提取成本等因素的影响,集成提取茯苓多糖的最佳工艺条件为酶法+微波法.该工艺提取条件温和提取方式简单,提取时间较短,多糖提取效率较高.在茯苓菌核多糖的分离工艺试验中,酶法与微波法集成的先后顺序对茯苓多糖提取率的影响不是太大.而酶法与微波法同热水浸提法集成工艺的茯苓多糖提取率与酶法与微波法集成工艺的茯苓多糖提取率相比增加幅度不大, 说明酶法与微波法集成工艺可以有效提取茯苓菌核多糖.另外,本研究主要针对茯苓菌核多糖的集成工艺进行了研究, 而多糖分离方法对多糖的结构和生物活性的影响需继续深入探讨.