《武汉工程大学学报》 2013年06期
30-34
出版日期：2013-06-30
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
香菇多糖和金针菇多糖的提取及其抑菌活性
0引言近年来，关于香菇多糖抑菌活性的报道较多，香菇多糖对枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌都有一定的抑制作用，对鸡白痢沙门氏杆菌和禽多杀性巴氏杆菌也有抑制作用\[12\]；金针菇多糖具有提高免疫力、保肝和抗氧化等功能\[3\]，但关于其抑菌活性的报道较少；另外，有关香菇菌柄多糖抑菌活性的报道较少.本实验测定了金针菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的抑制作用，同时对香菇菌柄多糖的提取工艺进行了优化，为食用菌多糖作为杀菌剂的开发和应用提供了依据.1实验部分1.1材料1.1.1菌株金针菇(Flammulina velutipes)12、香菇(Lentinus edodes)39、大肠杆菌(Escherichia coli)8099、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538和白色念球菌(Candida albicans)ATCC10231，均由本实验室保藏. 1.1.2香菇菌柄市售鲜香菇，取菌柄置于60 ℃烘箱内烘干，粉碎过孔径为0.15 mm筛子，密封，置于干燥器中保藏，备用.1.1.3仪器与试剂主要仪器：恒温培养箱（DNP9162，上海精宏实验设备有限公司）、恒温摇床（SKY200B，上海苏坤实业有限公司）、超净工作台（CJ2D，天津市泰斯特仪器有限公司）、游标卡尺（申工0～150 mm，上海申韩量具有限公司）、电子天平（BL220L，岛津国际贸易上海有限公司）、振荡器（VTX3500，LMS CO.,LTD.）、离心机（TG16WS，长沙湘智离心机仪器有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG9053A，上海精宏实验设备有限公司）、旋转蒸发器（R201，郑州长城科工贸有限公司）、循环水式多用真空泵（SHBIIIA，郑州长城科工贸有限公司）、数显恒温水浴槽（DKS24，上海精宏实验设备有限公司）、高压灭菌锅（LDZM60KCS，上海申安医疗器械厂）、细菌过滤器（E100，北京众益中和生物技术有限公司）和分光光度计（722E，天津市普斯特仪器有限公司）等.主要试剂：乙醇（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、苯酚（分析纯）、葡萄糖（化学纯）、磷酸二氢钾（化学纯）、磷酸氢二钾（化学纯）和硫酸镁（化学纯）等，均为市售.1.1.4培养基完全培养基(Complete Yeast Extract Medium)\[45\]，牛肉膏蛋白胨培养基(Beef extract Prptone Medium)\[2\]，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar Medium，PDA)：马铃薯20 g ，葡萄糖2 g，琼脂18 g，加入蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4.1.2方法1.2.1金针菇和香菇的液体培养按文献\[45\]的方法进行金针菇和香菇的液体培养. 1.2.2发酵液中胞外多糖的提取金针菇和香菇终止发酵后，按文献\[45\]的方法进行发酵液中胞外多糖的提取，得多糖粗制品，60 ℃烘干，置于干燥器中保藏，备用.第6期胡国元，等：香菇多糖和金针菇多糖的提取及其抑菌活性武汉工程大学学报第35卷1.2.3香菇菌柄多糖的热水浸提影响多糖提取得率的主要因素有浸提温度、浸提时间和料液比等\[67\]. 根据预实验结果，选择料液比、浸提温度、浸提时间3项为考察因素，各取3个水平，即料液比（g∶mL）：1∶20，1∶30，1∶40，浸提时间：0.5，1.0，1.5 h，浸提温度：96，98，100 ℃，进行L9(33)正交试验设计（见表1）. 取27个250 mL三角瓶，分为9组，编号1～9组，每组重复3次，在每个三角瓶中加入1.0 g香菇菌柄粉末，按料液比加入蒸馏水，封口，恒温浸提一段时间，浸提两次，合并两次浸提液，多糖分离工艺同1.2.2. 采用苯酚硫酸法\[8\]测定浸提液中多糖的含量，通过比较9个处理组浸提液中多糖的含量确定最优热水浸提方案.表1热水浸提法正交试验L9(33)因素及水平Table 1Factors and Levels of orthogonal tests ofhot water extraction method水平因素A料液比/(g∶mL)B浸提时间/hC浸提温度/℃11∶200.59621∶301.09831∶401.51001.2.4微波法与热水浸提法复合提取香菇柄多糖采用1.2.3的最优热水浸提料液比，选定微波炉的功率为480 W，微波处理时间设计4个水平，即为1、2、3、4 min，微波处理后按1.2.3的最优热水浸提方案进行，通过比较4个处理组浸提液中多糖的含量确定最优微波处理时间.1.2.5多糖母液的配制将发酵法制备的金针菇、香菇胞外多糖和采用优化的微波法与热水浸提法复合提取香菇菌柄多糖粗制品溶于蒸馏水中，配制成50 mg·mL-1的粗多糖溶液.采用苯酚－硫酸法\[8\]测定粗多糖溶液中多糖的含量，经孔径为0.45 μm微孔滤膜过滤，得到无菌滤液，置于冰箱(4 ℃)中保藏，备用.1.2.6供试菌悬液的制备将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基制成的斜面上，分别置于恒温培养箱中37、37、28 ℃培养24 h，进行菌株活化，活化好后，分别挑取一环各菌菌苔，用无菌生理盐水进行稀释，制成含菌量为106～108 cfu·mL-1\[2,9\]，置于冰箱(4 ℃)中保藏，备用.1.2.7滤纸片的制备用打孔器将定性滤纸加工成直径为6.0 mm的圆形滤纸片，灭菌备用.1.2.8抑菌实验及抑菌圈直径测定在固体培养基平板上加入200 μL菌悬浮液并涂布均匀，做成含菌平板，将已灭菌的滤纸片放入一定浓度的多糖无菌溶液中浸泡30 min，对照同步处理；用灭菌镊子夹出各滤纸片贴于各菌营养平板上，并加对照处理，重复三次，置于恒温培养箱中倒置培养24 h，取出，用十字交叉法，测量抑菌圈直径大小，取平均值\[2\].1.2.9最小抑菌浓度（MIC)的测定将待测多糖水溶液用2倍稀释法\[10\]稀释成一系列溶液，每个浓度多糖溶液的抑菌实验方法同1.2.9，以有抑菌圈的最低浓度为最小抑制浓度.1.2.10数据分析方法采用Microsoft Excel 2003 软件进行数据分析.2结果与讨论2.1香菇菌柄多糖热水浸提法的正交试验香菇菌柄多糖热水浸提法的正交试验结果与分析见表2.表2正交试验结果与分析Table 2Results and analysis of orthogonal design tests试验编号因素ABC多糖含量/%11114.4021223.8331333.7542124.5652234.6062315.1973133.7783214.1693324.95K13.994.254.59K24.784.204.45K34.294.634.04R0.790.380.55注：表中数据均为3次重复试验的平均值，以下同.由表2可知，根据统计学原理，极差R的值越大，说明此因素对实验的影响越大.由于RA>RC>RB，所以，3个影响因素中A（料液比）对香菇菌柄多糖的提取效率影响最大，其次为C（浸提温度），影响程度最小的是B（浸提时间），影响多糖浸提效率的主次顺序是A>C>B. 从表2还可知，A因素中K2值最大，B因素中K3值最大，C因素中K1值最大，即A2B3C1为香菇菌柄多糖的提取的最佳处理组，提取香菇菌柄多糖的最佳条件为：料液比为1∶30（g∶mL），浸提时间为1.5 h，浸提温度为96 ℃，浸提2次，香菇菌柄浸提液中多糖的含量达5.19%.2.2微波处理对香菇菌柄多糖热水浸提法影响的单因素试验由表3可知，在最优热水浸提条件下，最佳的微波处理时间为3 min，经微波预处理后，热水浸提法提取多糖的含量为5.68%，比最优热水浸提法提取多糖的含量高出0.48%.表3微波处理时间对多糖提取的影响Table 3Effects of microwave time on extracting ofpolysaccharide时间/min1234 多糖含量/%4.604.915.684.48注：微波炉的功率为480 W.2.3各多糖母液中多糖的含量测定50 mg·mL-1金针菇胞外粗多糖溶液中胞外多糖的含量为8.5 mg·mL-1，50 mg·mL-1香菇胞外粗多糖溶液中胞外多糖的含量为4.8 mg·mL-1, 50 mg·mL-1香菇菌柄多糖溶液中多糖的含量为9.3 mg·mL-1；抑菌实验时，将香菇菌柄多糖母液中多糖的质量浓度稀释为4.8 mg·mL-1（与香菇胞外多糖母液的多糖含量一致，便于评价同一浓度下两种香菇多糖的抑菌活性的差异）.2.4金针菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的抑菌活性由表4可知，金针菇胞外多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均无抑制作用；香菇胞外多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均有抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制作用效果最好，结果与张嫚\[2\]等的研究结论相似，香菇多糖对革兰氏阴性菌的抑制作用强于革兰氏阳性菌；香菇菌柄水溶性多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌亦均有抑制作用，但抑菌效果均较差；香菇胞外多糖与香菇菌柄水溶性多糖之间的抑菌活性存在差异，可能与它们的多糖结构不同有关，金针菇胞外多糖对供试3株菌株无抑制作用，有待进一步探讨.表4金针菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的抑菌活性Table 4Antimicrobial activities of F. velutipes polysaccharide and L. edodes polysaccharide实验组别抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念球菌对照6.00±0.006.00±0.006.00±0.00金针菇胞外多糖6.00±0.006.00±0.006.00±0.00香菇胞外多糖10.76±0.287.85±0.128.37±0.11香菇菌柄多糖6.98±0.036.36±0.336.75±0.25注：滤纸片直径6.00 mm，实验组金针菇胞外多糖的质量浓度为8.5 mg·mL-1，香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的质量浓度均为4.8 mg·mL-1.2.5香菇多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌浓度(MIC)由表5可知，香菇胞外多糖的抑菌效果随浓度呈上升趋势，结果与张嫚\[2\]等的研究结论相似；香菇胞外多糖对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为0.15 mg·mL-1，对金黄色葡萄球菌、白色念球菌的最小抑菌质量浓度均为4.8 mg·mL-1；由表6可知，香菇菌柄多糖对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为2.4 mg·mL-1，对金黄色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌质量浓度亦均为4.8 mg·mL-1；香菇胞外多糖对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度明显低于香菇菌柄多糖对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度.表5香菇胞外多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌浓度Table 5The MIC of L. edodes exopolysaccharide against E. coli, S. aureus and C.albicans香菇胞外多糖的质量浓度/（mg·mL-1）大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念球菌4.8++++++2.4++--1.2++--0.6+--0.3+--0.15+--0.075---注：“-”表示无抑菌圈；“+”表示抑菌圈在6～8 mm；“++”表示抑菌圈在8～10 mm；“+++”表示抑菌圈在10 mm以上.表6香菇菌柄多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的最小抑菌浓度Table 5The MIC of L. edodes polysaccharide againstE. coli, S. aureus and C. albicans香菇菌柄多糖的质量浓度/（mg·mL-1）大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念球菌4.8+++2.4+--1.2+--注：“-”表示无抑菌圈；“+”表示抑菌圈在6～8 mm；“++”表示抑菌圈在8～10 mm；“+++”表示抑菌圈在10 mm以上.3结语在最佳工艺条件下，香菇菌柄浸提液中多糖的含量为5.68%.金针菇胞外多糖、香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖的抑菌活性测定结果：金针菇胞外多糖对3种供试菌株均无抑制活性，香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖对3种供试菌株均有不同程度抑制活性.具体小结如下：a.香菇菌柄多糖提取的最佳工艺为：料液比为1∶30（g∶mL），微波处理3 min（微波炉的功率为480 W），然后采用96 ℃热水浸提1.5 h，热水浸提2次.b.香菇胞外多糖对3种供试菌株的抑制作用由强到弱依次为大肠杆菌、白色念球菌和金黄色葡萄球菌. 香菇胞外多糖对大肠杆菌具有较好的抑制作用.c.香菇菌柄多糖对3种供试菌株的抑制作用由强到弱依次为白色念球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌. 香菇菌柄多糖对3种供试菌株的抑制作用相近.d.不同浓度的香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖对3种供试菌株的抑制作用不同，随着浓度的增加而增加.e.香菇胞外多糖和香菇菌柄多糖对3种供试菌株的抑制活性存在差异， 香菇胞外多糖的抑菌效果更好些.致谢感谢湖北省教育厅、武汉工程大学研究生处的资助.