《武汉工程大学学报》  2014年07期 12-16   出版日期：2014-07-31   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ
双臂大环稀土配合物的合成及其生物活性


0引言稀土配合物具有优异的光、电、磁性质，在许多方面有特殊用途，其理论研究对新材料、催化剂、新型药物等的开发有重要意义，已成为化学、材料学等学科发展的前沿课题之一［12］.含氮的大环配体具有环形空腔和多个氮原子配位点，对金属离子尤其是稀土离子具有超强的配位能力，并能与它们形成稳定的配合物.本课题组在双酚含氮大环稀土配合物的设计、合成、结构与性质研究方面作了大量的工作，获得了多个系列的单核、桥联双核、桥联四核稀土大环配合物并研究了其晶体结构、荧光性质及相关的生物活性［310］.为进一步发展新型的大环稀土配合物系列，本课题组近期用三足式有机胺（三氨基丙基胺trpn）与2,6二甲酰基4甲基苯酚在高氯酸铒为模板的条件下通过［2+2］缩合反应合成了一个新型的双臂大环稀土铒配合物［ErL］ClO4·2H2O（图1，L为失去两个酚氧氢离子的负二价双臂双酚大环配体），并通过元素分析、红外光谱、紫外光谱和电喷雾质谱对其进行了表征，配合物对DNA有较明显的切割活性和对大肠杆菌均有一定的抑制作用. 图1配合物［ErL］ClO4·2H2O的化学结构Fig.1The chemical structure of the compex ［ErL］ClO4·2H2O1实验部分1.1试剂与仪器合成所用试剂均为分析纯；丙烯腈和DMF为蒸馏得到；活性二氧化锰用分析纯MnCO3热分解制得；2,6二甲酰基4甲基苯酚和三氨基丙基胺（trpn）分别参照文献［10］合成，物理参数与文献值一致；其它试剂均为分析纯.配合物的电子吸收光谱在ShimadzuUV2450PC紫外分光光度计上测定；红外光谱在PerkElmerFTIR光度计上测量（KBr压片）；电喷雾质谱（ESMS）在Fininigan LCQ质谱仪测定，样品浓度约为1.0×10-3 mmol/dm3，样品稀溶液在针电压+4.5 kV下以5×10-6 dm3min-1喷雾，流动相为甲醇，收集正离子处理.1.2配合物［ErL］ClO4·2H2O的合成称取286.1 mg Er(ClO4)3·6H2O和82.4 mg 2，6二甲酰基4甲基苯酚，溶解于20 mL无水甲醇中，转移到100 mL三口瓶中，在回流温度下滴加94.5 mg trpn的甲醇溶液，滴加完毕后回流8 h,冷却至室温，过滤后用乙醚扩散，得到配合物黄色粉末99.69 mg，收率为44%.元素分析C36H58ClN6O8Er：实测值（计算值）∕%：C，47.68（47.75）；H，6.93(6.46)； N，8.87（9.28）.紫外可见光谱(λmax/nm) \[ε/(dm3·mol-1·cm-1)\]:268(39 700),398(17 400);红外光谱(cm-1): 3 428(—OH),1 653(——C——N—),1 100(ClO-4).第4期胡学雷，等：双臂大环稀土配合物的合成及其生物活性 武汉工程大学学报第36卷1.3与DNA的相互作用CTDNA溶液的配置：将CTDNA用pH为7.2的5 m mol/L TrisHCl,50 mmol/L NaCl缓冲溶液溶解后，用紫外光谱测定A260/A280=1.8，说明该CTDNA样品中不含蛋白质及苯酚.测定溶液在260 nm处的A值，通过Lambert定律A=εbc（ε=6 600 L/(mol·cm)）,计算出CTDNA的浓度.1.3.1紫外光谱配合物用重蒸的DMF溶解，配成数量级为10-5的溶液.以Tris缓冲溶液作为参照，向5×10-5 mol/L的配合物溶液和参照溶液中同时加入等量的DNA溶液，使DNA与配合物的浓度比值不断上升，直至饱和，放置一段时间测定配合物的紫外光谱.1.3.2荧光光谱溴乙锭（EB）与DNA按等体积混合的复合物溶液，以520 nm为激发波长，扫描EBDNA复合体系在540～740 nm范围的荧光光谱.逐渐减小配合物与EBDNA复合物溶液的浓度比，室温下依次测量其荧光光谱.荧光淬灭常数的计算根据公式［11］ F0/F=1+K［Q］其中F0为EBDNA溶液的荧光强度；F为配合物与EBDNA混合后的荧光强度；K为线性方程淬灭系数；［Q］为配合物的浓度.1.4对DNA的切割作用1.4.1溶液的配制TAE缓冲溶液，TrisHCl缓冲液，溴化乙锭染色液的配制，配合物溶液的制备均见参考文献［9］.1.4.2凝胶的制备准确称取0.5 g琼脂糖粉加入到100 mL锥形瓶中，加入1 mL TAE缓冲溶液和50 mL水，封好口后在微波炉中加热5 min，琼脂糖完全溶解，冷却至60 ℃，加几滴EB溶液，使得溶液显淡红色，将液体倒入带梳子的水平槽中，室温放置30 min后，待胶冷却好，将水平槽放入电泳槽中.1.4.3时间、浓度对切割的影响时间的影响：0号试管中加入空白对照缓冲液，1～5号中加入相同浓度的配合物，不同切割时间下观察切割效果.浓度的影响：0号试管中加入空白对照缓冲液，1～5号中加入1 μL DNA和10 μL配合物溶液（浓度分别为200、400、600、800 μmol/L）.1.5抑菌活性实验菌株为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌.固体培养基为琼脂培养基.将培养基分装，液体分装高度为试管高度的1/4，固体分装体积为三角瓶的1/2.将琼脂培养基在微波炉中加热至熔化，冷却至50 ℃左右，将20 mL培养基均匀的铺在表面皿的表层，冷却凝固.将在液体培养基中扩大培养复苏的菌种接种到上述培养基中.把直径6 mm经高压蒸汽灭菌的滤纸片，分别投入已经配好的不同浓度的配合物溶液和对照样及DMSO溶液中，浸泡2 min后备用.取20 μL浓度为105 cfu/mL的菌液，均匀的倒入上述铺有培养基的表面皿中.把抑菌片置于该培养基中，在37 ℃的电热恒温箱中培养24 h，测量每个抑菌片上产生的透明抑菌圈直径.2结果与讨论2.1合成与表征配合物在DMF中的电子吸收光谱处于268 nm的吸收峰归属为苯环上π-π*电子跃迁；398 nm处的吸收峰为含有C——N生色团的π-π*电子跃迁，表明原料2,6二甲酰基4甲基苯酚与三氨基丙基胺trpn中的羰基和氨基发生缩合形成C——N双键.配合物红外光谱在1 680 cm-1附近没有出现原料2，6二甲酰基4甲基苯酚的C——O的吸收峰，而在1 653 cm-1处有很强的C——N吸收峰，同样证实了C——N基团的形成;而在1 100 cm-1处为游离的高氯酸根的特征吸收峰，表明配合物为离子型配合物.2.2电喷雾质谱图2为配合物［ErL］ClO4·2H2O的阳离子电喷雾质谱图，质谱峰的归属列于表1.基峰质荷比为m/z=803.2，归属为配合物的分子离子峰［Er3+L(CH3OH)］+，系配合物失去阴离子ClO-4再结合一个甲醇分子形成；处于m/z=413.6质谱峰归属为基峰［Er3+L(CH3OH)］+结合一个质谱系统内存在的微量的钠离子形成的二价碎片［Er3+Na+L(CH3OH)］2+产生；在m/z=691.22、m/z=676.28和m/z=301.61处的质谱峰分别归属为［Na+(H2L)(CH3OH)2］+ 、［Na+ (H2L)(CH3OH)(H2O)］+ 和［(H+)2(H2L)］2+，它是配合物失去稀土离子后的中性大环配体在结合钠离子、氢离子及不同数量的甲醇和水分子形成.配合物在质谱条件下有［Na+(H2L)(CH3OH)2］+ 、［Na+(H2L)(CH3OH)(H2O)］+ 和［(H+)2(H2L)］2+碎片峰的产生显示了二十八元大环配合物［ErL］ClO4·2H2O比本课题组之前报道的二十四元大环配合物的稳定性稍差，这是由于较大的环与较小的中心离子不匹配产生的.配合物质谱图中没有观察到［2+3］型配合物或穴醚配体的裂解碎片，说明了2,6二甲酰基4甲基苯酚与三氨基丙基胺trpn在投料比为1∶1时，只发生了［2+2］缩合，结合元素分析结果，推断配合物的结构为图1所示.表1配合物［ErL］ClO4·2H2O的电喷雾质谱数据Table 1The ESMS spectroscopic data andassignments for the title complex ［ErL］ClO4·2H2O质荷比(m/z)相对丰度/%归属803.2100［Er3+L(CH3OH)］+691.2297［Na+(H2L)(CH3OH)2］+413.644［Er3+Na+L(CH3OH)］2+676.2830［Na+(H2L)(CH3OH)(H2O)］+301.6124［(H+)2(H2L)］2+图2配合物［ErL］ClO4·2H2O在甲醇溶液中的电喷雾质谱Fig.2Positiveion ES mass spectrum of the complex ［ErL］ClO4·2H2O in methanol2.3配合物与DNA的相互作用2.3.1电子吸收光谱图3是配合物与DNA相互作用的电子吸收光谱图.随DNA浓度增加，配合物在390～410 nm处的吸收峰发生了减色效应和红移现象，可以初步判断配合物以插入方式与DNA作用.减色可能的原因是配合物与DNA结合后,其π*空轨道与DNA碱基的π轨道发生偶合，从而使π*空轨道填充了电子，发生π→π*跃迁的几率减少.按文献［12］方程：［DNA］/|εa-εf|=［DNA］/|εb-εf|+1/Kb|εb-εf|其中：［DNA］为CTDNA的浓度；εa为配合物与CTDNA共存时的表观摩尔吸光系数；εf为配合物单独存在时的摩尔吸光系数；εb为与DNA结合的配合物的摩尔吸光系数.以［DNA］/ |εa-εf |对［DNA］作图，可以得到结合常数Kb的值为1.20×104，处在配合物以插入方式结合DNA的结合常数104~106之内. 图3配合物随DNA浓度的增加的电子吸收光谱Fig.3Absorbance spectra of complex in the absence and presence of increasing amounes of CTDNA注：CTDNA的浓度为C1＝0 μmol/L,C2＝10.98 μmol/L,C3＝21.43 μmol/L,C4＝40.91 μmol/L,C5＝75.00 μmol/L.2.3.2荧光光谱图4是配合物［ErL］ClO4·2H2O与EBDNA体系相互作用的荧光光谱图，随着配合物浓度的增大，EBDNA复合体系的荧光强度有明显的淬灭，说明配合物可能取代了EBDNA体系中部分的EB分子，导致体系荧光逐渐减弱，进而说明配合物与DNA的作用方式与EB和DNA结合方式类似，均为插入结合方式\[12\]. 图4配合物对EBDNA体系的荧光淬灭图Fig.4Flourescence spectra of EBDNA in the absence andpresence of ternary complex. Arrows concentration of complex注：C1＝0 μmol/L,C2＝2.08 μmol/L,C3＝4.02 μmol/L,C4＝5.77 μmol/L,C5＝7.40 μmol/L.2.4配合物［ErL］ClO4·2H2O对DNA的切割作用图5是在pH为7.2、反应温度和时间分别为37.5 ℃和6 h时，不同浓度配合物切割DNA凝胶电泳图.实验表明配合物能将DNA切割成环形缺刻，随着配合物浓度的增大，切割的活性变化不明显.配合物对DNA具有一定的切割活性. 图5不同浓度配合物切割PBR322 DNA的凝胶电泳图Fig.5Agarose gel electrophoresis for the cleavage of PBR322 DNA by different concentrations of complex注：Lane1为control；Lane2为200μmol/L 配合物+DNA，6.0 h；Lane3为400μmol/L 配合物+DNA,6.0 h；Lane4为600μmol/L 配合物+DNA，6.0 h；Lane5为800μmol/L 配合物+DNA，6.0 h.2.5配合物［ErL］ClO4·2H2O的抑菌活性图6为配合物［ErL］ClO4·2H2O对大肠杆菌的抑制作用的效果图.浸泡配合物菌样滤片周围产生了明显比浸泡对照稀土盐较大的抑菌圈，配合物［ErL］ClO4·2H2O对大肠杆菌的生长有抑制作用，并且相应的无机稀土盐的抑菌效果好，但配合物浓度增加对抑菌效果没有明显的影响. 图6配合物对大肠杆菌的抑制作用Fig.6Effect on bacteriostasis of E.coli of complex注：（a）空白样；(b)为对照硝酸铒溶液，质量浓度为2 mg/mL；(c)、(d)、(e)分别为不同质量浓度0.5 mg/mL,1 mg/mL,2 mg/mL的配合物溶液；大肠杆菌浓度为105 cfu/mL.3结语采用模板法用二元醛和三元有机胺进行缩合反应一般会得到三维［2+3］型笼型配合物，其前提是投料比为2∶3和所形成的穴醚配体与模板金属离子半径匹配.本实验用投料比为1∶1的2，6二甲酰基4甲基苯酚和相对较长的三（3氨基丙基）胺 (trpn) 在相对较小的Er3+离子存在下也能发生［2+2］模板缩合反应并合成了一个新型的悬臂大环稀土铒配合物［ErL］ClO4·2H2O.通过元素分析、红外光谱、紫外光谱和电喷雾质谱对配合物进行了表征.标题配合物具有一定的DNA切割活性和对大肠杆菌也有一定的抑制作用.致谢感谢湖北省科技厅的资助.