链状球菌蛋白G（protein G），是一种来自链状球菌的细胞壁蛋白。分子量约为25 kDa。由3个白蛋白结合域（ABD1，ABD2，ABD3）和免疫球蛋白结合域构成。与protein A相似，protein G可与IgG的Fc区特异性结合，但是protein G能够特异性结合的抗体种类更加广泛，对于非常见物种IgG的结合能力也比较好，血清蛋白结合水平更低，纯度也更高。
Q-琼脂糖亲和介质离子交换层析法是一种将三甲胺基烷基季铵基键合在琼脂亲和介质（蓝胶）上形成的带有强碱阴离子基团的层析分离介质［5］的方法。这种方法保留了琼脂糖极好的亲水性及大网架结构与生物活性大分子有很好的相容性，具有离子交换容量高、非特异性吸附少、流速快、物理及化学稳定、配基不易脱落、使用寿命长等特点。
抗体提取纯化的方法有沉淀法、离子交换层析法、亲和层析法、尺寸排阻色谱法、蛋白质A和蛋白质G等［6］，根据抗BTA单克隆抗体分子的特点，G柱亲和层析和蓝胶加Q柱层析两种提取方法较好，利用SDS-PAGE 电泳和ELISA等方法对抗体进行检测［7］，运用统计学方法对所提取抗体和杂蛋白进行分析［8］。
1 实验部分
1.1 材料与仪器
1.1.1 仪器 G柱（武汉雁达生物技术有限公司）、蓝胶（武汉雁达生物技术有限公司）、Q柱（武汉雁达生物技术有限公司）、蛋白纯化仪AKTA（上海东贺生物技术有限公司）、离心机（华普仪器/HOLDPEAK）、-25 ℃冰箱、分光光度计（UV-6800）、核酸蛋白检测仪（HD-1）、垂直电泳槽（上海勤翔科学仪器有限公司）、调速振荡器（QHZ-98B）、酶标仪（北京普朗新技术有限公司）、洗板机（DG3090）、移液器（Eppendorf AG）、恒温箱（DHP-9012）。
1.1.2 试剂 BTA、无血清培养基、甘氨酸（0.1 mol/L pH 2.7）、缓冲液（0.01 mol/L pH 8.3 Tris+ 0.2 mol/L NaCl）、超纯水、Marker试剂，20 mmol/L Tris（pH=8.0）、10 mmol/L PB+100 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris+1.5 mmol/L NaCl、10 mmol/L PB+30 mmol/L NaCl。
1.2 方法
1.2.1 制备抗BTA单克隆抗体 以BTA为免疫原，选取健康Balblc小鼠11只，首次免疫用100微克/只的BTA和等体积弗式完全佐剂，背部多点注射免疫小鼠；首次免疫14 d后，每隔7 d，按50微克/只的BTA和等体积弗式不完全佐剂免疫小鼠，共免疫4次。4次免疫后取小鼠尾部血清，用间接ELISA法检测血清效价；若抗体效价高于1×10-5 mg/mL，对其进行腹腔加强免疫。1 d后，进行细胞融合。
将处死小鼠置于37 ℃预热的无血清培养基，得到脾脏，收集sp2/0骨髓瘤细胞，置于50 mL离心管。将sp2/0和小鼠脾细胞分别离心5 min（速率1 500 r/min），弃上清，加入无血清培养基悬浮沉淀，相同条件离心3次。将脾细胞加入到sp2/0管中，离心5 min（1 500 r/min），弃上清。将此离心管置于37 ℃水浴中，加入已经37 ℃预热的PEG1500溶液1 mL，再边搅拌边加入已经37 ℃预热的无血清培养基10 mL。然后补加培养基至20 mL，离心10 min（960 r/min），弃上清。将沉淀细胞轻悬于20%（体积分数）小牛血清200 mL HAT培养基中，加入到10块96孔细胞培养板中，每孔200 μL置于37 ℃，5%（体积分数）CO2培养箱中培养。6 d后，将原来的培养基全部吸净，每孔加200 μL HAT培养基，间接ELISA法检测，筛选得到阳性的杂交瘤细胞。最后挑选10周龄的BALB/C雌性小鼠10只，腹腔注射石蜡，1 mL/只。用生理盐水稀释杂交瘤细胞到1×106 /mL，0.5毫升/只，腹腔注射。7 d后吸取腹水，离心5 min（3 000 r/min），取上清，-25 ℃保存［9］。
1.2.2 BTA抗体的提取
（1）Protein G亲和层析法。缓冲液平衡G柱；取5 mL腹水，离心5 min（5 000 r/min）针孔过滤器过滤后稀释1倍上样，加入缓冲液平衡G柱，收集流出液；以0.1 mol/L甘氨酸（pH 2.7）为解离液洗脱目的蛋白，根据核酸蛋白检测仪收集含蛋白成分试样；用缓冲液清洗柱，各流出液用分光光度计测OD280［10］。
（2）蓝胶加Q层析法。20 mmol/L Tris（pH=8.0）平衡蓝胶柱，使核酸蛋白检测仪OD280值调零；取5 mL腹水，离心5 min（5 000 r/min）针孔过滤器过滤后稀释一倍上样；加入20 mmol/L Tris（pH=8.0）平衡蓝胶柱，收集蓝胶流出液；以20 mmol/L pH 8.0 Tris+1.5 mmol/L NaCl清洗蓝胶柱，以超纯水再次清洗，收集蓝胶洗脱液；换上Q柱，以20 mmol/L Tris（pH=8.0）缓冲液平衡，使核酸蛋白检测仪OD280值调零；将上述蓝胶流出液上样，加入20 mmol/L Tris （pH=8.0）平衡Q柱，收集Q柱流出液；以10 mmol/L PB（pH=7.4）+30 mmol/L NaCl为洗脱液洗脱杂蛋白，收集Q柱洗脱液Q30。以10 mmol/L PB（pH=7.4）+100 mmol/L NaCl洗脱目的蛋白，收集Q柱解离液Q100。用20 mmol/L Tris（pH=8.0）+1.5 mol/L NaCl清洗Q柱，再用超纯水清洗，收集Q柱洗脱液Q1.5；各流出液用分光光度计测OD280。
1.2.3 两种提取抗BTA的抗体分析
（1）SDS-PAGE?电泳。将Protein?G柱亲和层析和蓝胶加Q柱层析过程中得到的G柱解离液、G柱过程中各时期的流出液、蓝胶流出液、蓝胶洗脱液、Q柱流出液、Q柱洗杂液、Q柱解离液、Q柱洗脱液、及小鼠腹水加入Buffer缓冲液沸水浴5 min后，配置成如下体系的试样体系：5.0 μL腹水+15.0 μL超纯水+20 μL Buffer，20 μL解离液+20 μL Buffer，20 μL各流出液+20 μL Buffer，将得到的试样各取6 μL和6 μL标准液按照编号依次进样。进行不连续电泳：电泳（99 V，15 min）至条带到达浓缩胶与分离胶交界处，提高电压继续电泳（230 V，40 min）至条带距胶板2 cm，停止电泳。剥胶振荡染色，冲洗后观察胶板［11-12］。
（2）紫外分光光度计测蛋白质量浓度。PB溶液调零紫外分光光度计，多次测定OD数值，取其平均值。
含量计算公式［13］：IgG 蛋白含量（mg/mL）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数
酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法：将基准抗体和待测抗体同步包板，干燥完成后，向S0-S5的标准品横向加样25微升/孔，加样完成立刻加入按效价稀释的酶工作液（50微升/孔），经振荡机混匀10 s用封板膜封板，放入37 ℃恒温箱。45 min后小心揭掉封板膜，洗板机洗5次，将板扣干。每孔加入底物A、B液各50 μL，轻拍混匀，盖上封板膜，放入37 ℃温箱，反应10 min后每孔加入50 μL终止液，混匀，立即用酶标仪双波长为450 nm/630 nm测定各孔OD值［14］。
2 结果与讨论
2.1 小鼠腹水样品
通过处理共得250 mL小鼠腹水。
2.2 腹水的蛋白成分组成与不同批次成分的差异性
5个批次的小鼠腹水分别通过G柱亲和层析［15］和蓝胶加Q柱离子层析进行提纯，利用核酸蛋白检测仪记录其提纯过程OD280数值，以时间为横坐标吸光度为纵坐标，绘制点线图，见图1。
<G:\武汉工程大学\2022\2022-06工程\Image\徐瑶瑶-1-1.tif><G:\武汉工程大学\2022\2022-06工程\Image\徐瑶瑶-1-2.tif>[0 5 10 15 20 25 30
t / min][120
100
80
60
40
20][OD280（Abs）][ a ][ b ][140
120
100
80
60
40
20][OD280（Abs）][0 10 20 30 40 50 60 70
t / min][第一次试验
第二次试验
第三次试验
第四次试验
第五次试验][第一次试验
第二次试验
第三次试验
第四次试验
第五次试验]
图1 对不同批次腹水中蛋白含量的测定曲线：
（a）G柱亲和层析，（b）蓝胶加Q柱离子交换层析
Fig. 1 Determination curves of protein content in
different batches of ascites ：（a） G-column chromatography，
（b） blue gum plus Q-column chromatography
G柱法（a）于0~15 min洗脱杂蛋白，于15~18 min解离液洗脱目的蛋白；Q柱+蓝胶法（b）于0~10 min通过蓝胶柱洗脱白蛋白，10~15 min解离液洗脱目的蛋白，20~34 min解离液上样Q柱，40~46 min低浓度解离液洗脱杂蛋白，50~60 min高浓度解离液洗脱目的蛋白，65~70 min为清洗柱。
两种提纯方法各批次的流出峰峰高和流出时间基本一致，说明杂质蛋白和目的蛋白种类一致，不同批次的腹水成分差异不大。杂蛋白流出峰均高于目的蛋白流出峰，说明腹水中杂蛋白比例较高；蓝胶+Q柱法（b）蓝胶流出峰1远高于由其他杂蛋白和目的蛋白组成的峰2可知杂蛋白主要成分为白蛋白。
2.3 不同提纯方法对抗体纯度的影响
通过SDS-PAGE凝胶电泳法分别对G柱和Q柱加蓝胶方法提纯所得解离液（含目的蛋白）和各流出试样进行分析，见图2。
<G:\武汉工程大学\2022\2022-06工程\Image\徐瑶瑶-2-1.tif><G:\武汉工程大学\2022\2022-06工程\Image\徐瑶瑶-2-2.tif>[1 2 3 4 5][75
48
25] [ b ] [75
48
25][1 2 3 4 5 6 7 8 9][ a ]
注：（a）1.水；2.流出液；3.解离液；4.标准液；5.Marker；（b）1.腹水；2.蓝胶流出液；3.蓝胶洗脱液；4.Q柱流出液；5.Q柱30 mmol/L流出液；6.Q柱100 mmol/L流出液；7.Q柱1.5 mmol/L洗脱液；8.标准液（对照用）；9.Marker
图2 两种提取方法电泳图谱比较，
（a）G柱亲和层析，（b）蓝胶加Q柱离子层析
Fig. 2 Comparison of electrophoresis patterns of two
extraction methods： （a） G-column chromatography，
（b） blue gum plus Q-column chromatography
抗体的轻链重链结构在电泳后分布于-25、
-48 kDa条带，由a3、b6泳道可知两种提纯方法的解离液都含有抗体；G柱（a）方法样品2和Q柱加蓝胶（b）方法样品2，3，4，5，7在各流出液和洗脱液中-50和-25条带不可见，杂带多且量大，说明主要成分为杂蛋白，两种方法的提纯过程抗体几乎没有损失，得到高纯度的抗膀胱肿瘤抗原单抗。
2.4 不同提取方法对抗体含量的影响
2种方法提取的样品溶液均透明，利用其光吸收特性通过紫外分光光度计法确定样品中的抗体含量。5批5 mL小鼠腹水样品经2种方法提纯后测定吸光度确定蛋白质浓度，数值以平均值±标准偏差表示，并通过SPSS25对2种方法提纯的样品进行配对样本t检验分析后将浓度乘以解离液体积得到抗体含量。
从表1可知，2种方法提取的蛋白质抗体含量有显著差异，G柱法得到的抗体含量显著高于蓝胶加Q柱法。抗体与离子交换剂电荷之间的相互作用强度较低，而G柱亲和层析以小分子为配体［13-15］能更好结合抗体的Fc段和Fab段提高提纯效果。该鼠抗人膀胱肿瘤抗原单抗适用G柱亲和层析法。
表1 两种方法提取的小鼠腹水蛋白质含量比较
Tab. 1 Comparison of protein content in mouse ascites
extracted by two methods
[提取方法 样品批次总数 蛋白质含量 / mg G柱亲和层析 5 9.686±0.106a 蓝胶加Q柱离子层析 5 8.106±0.634b ]
注：同列并肩小写字母不同表示差异显著（P<0.05）；腹水：5 mL
2.5 不同提纯方法对抗体亲和力影响
通过ELISA双抗夹心法对该抗BTA单抗定性定量分析。以CN032作为包被抗体，基准酶标CN034H作为标记抗体，标准抗体作为基准物，测量样品双波长450 nm/630 nm下的OD值。测量5批腹水以2种提取方法获得的抗体在不同梯度相同浓度下的亲和力差异，数值以平均值±标准偏差表示。
以Protein G亲和层析法和Q-琼脂糖亲和介质离子交换层析法（蓝胶加Q柱层析法）分别提取抗体，用ELISA双抗夹心法对该抗BTA单抗定性定量分析。可以看出，通过G柱法提取的抗体亲和力更高，每毫升样品60 ng的两种方法提取的抗体亲和力更具有差异性（图3）蓝胶加Q柱生产样品活性（抗体亲和力）为市售基准的97.11%（质量分数），G柱生产样品活性为基准的101.55%（质量分数）（表2）。
<G:\武汉工程大学\2022\2022-06工程\Image\徐瑶瑶-3.tif>[0 2 5 10 20 60
质量含量 / ng][0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
][平均OD值][基准物
蓝胶加Q柱
G柱
]
图3 两种方法提取抗体的ELISA结果制图
Fig. 3 ?Mapping of ELISA results of antibodies extracted by two methods
3 结 论
以SDS-PAGE 电泳、紫外分光光度计测蛋白浓度、酶联免疫吸附试双抗体夹心法对两种不同方法提取的抗BTA单克隆抗体进行分析，通过G柱亲和层析和蓝胶加Q柱层析分别对小鼠腹水中的抗BTA单克隆抗体进行了分离纯化，结果经统计分析表明分别采取这两种方法的提纯过程抗体几乎没有损失，都得到高纯度的抗膀胱肿瘤抗原单抗。实验证明通过与市售基准比较G柱法在得到抗体含量和抗体亲和力方面的表现都略优于蓝胶加Q柱法。但蓝胶加Q柱法的参数检测结果也在可控范围内，满足纯化要求，本实验由于在ELISA实验中样品浓度设计导致实验数据偏低，且各类抗体的结构性质不同，因此我们猜想更换其他类型的抗体进行测试可能会得出不同的实验结果，在实际不同抗体提纯工业中，可根据实际工艺状况及质控要求进行选择。